A realização de testes de suscetibilidade antimicrobiana (TSA) em bastonetes Gram-negativos exige rigor técnico e metodológico:

Não fermentadores - disco difusão, fita de gradiente em ágar ou microdiluição em caldo.^1,2

Enterobacterales - automação, disco difusão, fita de gradiente em ágar ou microdiluição em caldo.^1,2

Cuidados para estocar discos e fitas de gradiente ³

• O controle de qualidade é essencial para avaliar os insumos utilizados no teste¹;
• Utilizar as cepas controle especificadas para monitorar o desempenho do teste¹;
• Verifique no BrCAST as recomendações das cepas controles para as diferentes classes de antimicrobianos. ¹

Etapas Recomendadas para Realização de Antibiograma¹

• Placas devem ser estocadas de acordo com a recomendação do fabricante e utilizadas dentro do prazo de validade
• A superfície do ágar deve estar seca antes do uso
• Preparar a suspensão a partir de um crescimento overnight em um meio não seletivo
• Ajustar a suspensão do inóculo de modo a obter turbidez equivalente ao padrão 0,5 da escala de McFarland
• A suspensão deve ser utilizada de preferência em até 15 minutos
• Aplicar os discos dentro de 15 minutos da semeadura
• Incubar as placas dentro de 15 minutos da aplicação do discos.

Fatores como inóculo fora do padrão, discos degradados, ausência de controle com cepas ATCC e erros de leitura podem comprometer os resultados. O controle de qualidade contínuo é essencial para garantir a confiabilidade dos testes. ¹

Casos Clínicos com Pseudomonas aeruginos³

Infecção urinária recorrente em paciente idosa

Uma paciente com histórico de ITU de repetição apresentou isolado multirresistente de P. aeruginosa. O teste mCIM foi positivo, e a detecção de carbapenemase revelou uma MBL do tipo VIM. O antibiograma indicou resistência a quase todos os antimicrobianos, com exceção da polimixina. Foram realizados testes de sinergia e determinação de CIM por microdiluição para orientar a conduta terapêutica.

Pneumonia associada à ventilação em paciente de 45 anos

O aspirado traqueal revelou P. aeruginosa com mCIM positivo, mas sensível aos carbapenêmicos. A resistência a ceftazidima/avibactam (CAZ/AVI) levantou suspeita de MBL, embora o NGCarba tenha sido negativo. Considerou-se a possibilidade de mutações em KPC ou MBLs não detectadas. O laudo final indicou resistência a CAZ/AVI e ceftolozana/tazobactam (C/T), com sensibilidade a meropenem.

Infecção respiratória em paciente idosa

Em um caso de infecção respiratória crônica, o lavado brônquico revelou Pseudomonas fluorescens. O mCIM foi positivo, e a repetição do teste com inóculo próximo ao disco de CAZ/AVI permitiu a detecção de NDM. O perfil de resistência era extenso, com sensibilidade apenas à polimixina.

Casos Clínicos com Klebsiella pneumoniae³

Infecção de corrente sanguínea em paciente jovem na UTI

A hemocultura revelou K. pneumoniae com produção de NDM, confirmada por mCIM e eCIM. A conduta laboratorial incluiu microdiluição para polimixina e testes de sinergia, conforme diretrizes internacionais.

ITU em paciente com histórico de cirurgia bariátrica

O sistema automatizado indicou resistência, e os testes fenotípicos revelaram mCIM positivo e eCIM negativo, sugerindo a presença de serino-β-lactamase. Foram recomendados testes adicionais para determinar CIM de CAZ/AVI e meropenem.

Infecção pós-operatória em paciente politraumatizado

O mesmo microrganismo foi isolado em secreção cirúrgica e hemocultura. O antibiograma indicou resistência a CAZ/AVI sem detecção de carbapenemase. A repetição do teste com inóculo próximo ao disco revelou coprodução de KPC e NDM. O perfil de resistência incluía resistência à polimixina, com sensibilidade apenas a amicacina e gentamicina.

Como aumentar a positividade do teste, antes de associar resistência a CAZ-AVI por aquisição? ⁴

Faça inóculo próximo ao disco e/ou fita de CAZ-AVI ou MEM!

Quando o inóculo de 1 µL é coletado próximo a um disco de antibiótico (ex.carbapenêmicos) o teste tornou-se positivo, aumentando a sensibilidade para NDM para 100% ⁴

Algumas modificações práticas para detecção de Carbapenemases e aumentar a positividade para MBL (NDM) - Teste Imunocromatográfico⁵

• Coloque o inóculo bacteriano com alça de 1uL  (a bula não define bem o inóculo) + solução extratora
• Homogeneizar em vórtex
• Aguardar 10 minutos independente do isolado (a bula recomenda apenas para isolados mucoides)
• Fazer o teste seguindo as orientações do fabricante
• Aguardar 15 minutos para a leitura final

O que pode levar a resultados falsos negativos no teste imunocromatográfico para detecção de NDN?

• Presença de inibidores ou interferentes –  uso de antibióticos recente, pode alterar a expressão da enzima ou modificar a estrutura da bactéria, afetando o reconhecimento pelo teste.⁶
• Baixa concentração de zinco no meio –  meios com baixo teor de zinco diminui a sensibilidade do teste para NDM.⁶
• Teste realizado com inóculo pequeno – os kits não padronizam o inóculo, mas a literatura relata um inóculo ideal como uma alça de 1uL totalmente preenchida.^6,7
• Co-produção  de Carbapenemaes – pode ocorrer detecção inicial apenas da enzima que tem maior nível de expressão.⁸
• Variantes atípicas da NDM -  algumas variantes da NDM (NDM-2, NDM-4, NDM-9, etc.) podem apresentar diferenças estruturais que reduzem a afinidade dos anticorpos usados no teste imunocromatográfico.^9,10
• Baixa expressão da enzima NDM-  produção insuficiente da enzima, o teste pode não detectar sua presença (regulação gênica alterada ou mutações que afetam a expressão da carbapenemase, baixo CIM para carbapenêmics).¹⁰
• Amostras com baixa carga bacteriana – amostra pode conter poucas células produtoras de NDM (culturas jovens ou velhas podem apresentar níveis variáveis de expressão de carbapenemase.10,11
• Erros técnicos no manuseio do teste -  Erros na execução do teste, como volume inadequado da amostra, tempo de incubação insuficiente ou condições de armazenamento inadequadas dos reagentes.¹¹

• Testes fenotípicos e genotípicos devem ser realizados antes da liberação de resultados para novos β-lactâmicos e inibidores.
• O controle de qualidade dos insumos deve ser contínuo e rigoroso.
• A resistência a CAZ/AVI em isolados produtores de KPC é rara e deve levantar suspeita de coprodução com MBL.
• A comunicação com a equipe médica é essencial para interpretar corretamente os resultados laboratoriais à luz do quadro clínico do paciente.

Referências:

1. Comitê Brasileiro de Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos - Método de disco-difusão BrCAST-EUCAST. Versão 12.0 do EUCAST.  Janeiro, 2024. Disponível em: https://brcast.org.br/wp-content/uploads/2022/09/Metodo-disco-difusao-BrCAST-15-04-2024.pdf [Acessado em: 28 de fevereiro de 2025].

2. Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. Módulo 10 – Detecção dos Principais Mecanismos de Resistência Bacteriana aos Antimicrobianos pelo Laboratório de Microbiologia Clínica. Brasília: Anvisa; 2020. Disponível em: https://www.gov.br/anvisa/ptbr/centraisdeconteudo/publicacoes/servicosdesaude/publicacoes/modulo-10_manual-de-microbiologia.pdf/view [Acessado em: 28 de fevereiro de 2025].

3. Caso clínico elaborado pelo autor.

4. Saleh A, Göttig S, Hamprecht AG. Multiplex Immunochromatographic Detection of OXA-48, KPC, and NDM Carbapenemases: Impact of Inoculum, Antibiotics, and Agar. J Clin Microbiol. 2018;56(5):e00050-18.

5. Laborclin Produtos para Laboratórios. NG - Test CARBA 5 [bula do produto]. Resp. Téc. Maire Wakamori. Rev. 5. Pinhais, PR. Setembro de 2024. Disponível em: https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2024/09/172311.pdf [Acessado em: 28 de fevereiro de 2025].

6. Saleh A, Göttig S, Hamprecht AG. Multiplex Immunochromatographic Detection of OXA-48, KPC, and NDM Carbapenemases: Impact of Inoculum, Antibiotics, and Agar. J Clin Microbiol. 2018;56(5):e00050-18.

7. Lee CH, Cao H, Jiang S, Wong TT, Tse CW, Ho PL. Inoculum Size and False-Positive Detection of NDM- and OXA-48-Type Carbapenemases Using Two Multiplex Lateral Flow Assays. Diagnostics (Basel). 2024;14(12):1274.

8. Song W, Park MJ, Jeong S, et al. Rapid Identification of OXA-48-like, KPC, NDM, and VIM Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae From Culture: Evaluation of the RESIST-4 O.K.N.V. Multiplex Lateral Flow Assay. Ann Lab Med. 2020;40(3):259-263.

9. Cheng Z, Thomas PW, Ju L, et al. Evolution of New Delhi metallo-β-lactamase (NDM) in the clinic: Effects of NDM mutations on stability, zinc affinity, and mono-zinc activity. J Biol Chem. 2018;293(32):12606-12618.

10. Boutal H, Moguet C, Pommiès L, Simon S, Naas T, Volland H. The Revolution of Lateral Flow Assay in the Field of AMR Detection. Diagnostics (Basel). 2022;12(7):1744.

11. Laborclin Produtos para Laboratórios. NG - Test CARBA 5 [bula do produto]. Resp. Téc. Maire Wakamori. Rev. 5. Pinhais, PR. Setembro de 2024. Disponível em: https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2024/09/172311.pdf [Acessado em: 28 de fevereiro de 2025].